한국 전통약주(진매, 수국, 구기자) 휘발, 비휘발 분획성분의 생리활성
휘발, 비휘발 분획성분의 생리활성
지도교수 이광근
동국대학교 식품공학과
김규동, 허재영, 안수훈, 김희진
2 0 0 5
국 문 요 약
전통약주에는 한약재인 약용식물의 잎이나 뿌리 등을 사용하고 제조과정 중 이로부터 각종 생리기능성 물질들이 생성되거나 용출되는 것으로 여겨져 전통약주의 건강기능성에 탐색과 활용에 대한 관심이 최근 증대되고 있는 실정이다. 본 실험에서 3종류의 전통약주 수국, 구기자, 천국을 SAFE(Solvent Assited Flavour Extraction)장치를 이용하여 휘발성분과 비휘발성분으로 추출하고 각 추출물을 분획기술을 이용하여 분획(fractionation)하였다. 그리고 gas chromatography/mass spectrometry(GC/MSD), gas chromatography-flame ionization detector (GC-FID)를 이용하여 휘발성분을 정성 정량 분석하였다. 대표적인 향기성분으로 진매에서 3-methyl butanol(34.30㎍/㎖), benzeneethanol(7.32㎍/㎖), hexadecanoic acid(47.22㎍/㎖), 1,2-benzenedicarboxylic acid(20.26㎍/㎖) 그리고 2-pentanone(127.15㎍/㎖) 이었으며 수국에서 Iso amy alcohol(32.74㎍/㎖), methinol(22.03㎍/㎖), ethyl 4-hydroxybutanoate(18.35㎍/㎖) 그리고 3-pyrrolidinol(10.31㎍/㎖)을 확인할 수 있었다. 그리고 구기자에서 1-pentanol(17.37㎍/㎖), 2,5-xylenol(12.70㎍/㎖),2(3H)-furanone(4.96㎍/㎖), benzeneethanol(30.95㎍/㎖) 그리고 α-glutaric acid(4.49㎍/㎖)가 확인 되었다. 3종류의 전통약주 휘발성분과 비휘발성분 항산화능은 hexanal/carboxylic acid Assay(휘발성분)와 lipid/MA Assay(비휘발성분)를 이용하여 측정하였고, 특정 fractions에 들어있는 특정 성분들에서 항산화능이 검정되었다.
차 례
국 문 요 약
Ⅰ. 서 론 1
Ⅱ. 재 료 및 방 법 3
1. 재 료 3
(1) 시약 및 표준물질 3
(2) 실험 재료 3
2. 방 법 4
(1) 분획을 이용한 성분 분석 4
1) 향기 성분 분리 4
2) 향기성분의 분획(Fractionation) 5
3) GC/MS에 의한 향기성분의 정성분석 5
4) 비휘발성분의 분획(Fractionation) 6
(2) 생리활성 실험 7
1) 휘발성분의 산화안전성 측정(Aldehyde/Carboxylic acid assay) 7
2) 비휘발성분의 산화안전성 측정 (Lipid/MA) 8
Ⅲ. 결 과 및 고 찰 9
1. GC에 의한 용매 검량선 10
2. 전통약주의 향기 성분 확인 12
1) 진매의 향기 성분과 함량 12
2) 수국의 향기 성분과 함량 15
2) 구기자의 향기 성분과 함량 18
3. Aldehyde/Carboxylic acid assay를 이용한 휘발성분의 항산화능 측정 21
1) 진매의 항산화능 측정 21
2) 수국의 항산화능 측정 23
3) 구기자의 항산화능 측정 25
4. Lipid/MA를 이용한 비휘발성분의 항산화능 측정 27
1) 진매의 항산화능 측정 28
2) 수국의 항산화능 측정 30
3) 구기자의 항산화능 측정 32
Ⅳ. 결 론 34
참 고 문 헌 35
Abstract 36
표 차 례
표1. 진매의 향기성분 13
표2. 수국의 향기성분 16
표3. 구기자의 향기성분 19
표4. Hexanal에 대한 각 fractions에서의 진매 향기 추출물의 항산 화효과 22
표5. Hexanal에 대한 각 fractions에서의 수국 향기 추출물의 항산 화효과 24
표6. Hexanal에 대한 각 fractions에서의 구기자 향기 추출물의 항 산화효과 26
그 림 차 례
그림 1. Calibration lines for GC/MS of solvent 11
그림 2. Hexanal에 대한 각 fraction에서의 진매 향기 추출물의 항산화 효과 22
그림 3. Hexanal에 대한 각 fraction에서의 수국 향기 추출물의 항산화 효과 24
그림 4. Hexanal에 대한 각 fraction에서의 구기자 향기 추출물의 항산화 효과 26
그림 5. 각 Fractions에서 cod liver oil로부터 형성된 MA에 대한 진매 비휘발 추출물의 항산화 효과 29
그림 6. 각 Fractions에서 cod liver oil로부터 형성된 MA에 대한 수국 비휘발 추출물의 항산화 효과 31
그림 7. 각 Fractions에서 cod liver oil로부터 형성된 MA에 대한 구기자 비휘발 추출물의 항산화 효과 33
Ⅰ. 서 론
술은 인류와 더불어 태어나고 인류가 생활한 자연환경에 따라 발전 해왔다. 따라서 세계 여러 나라에서 독특한 술이 창조되고 발전되어 현대 생활에서 빠질 수 없는 음료의 하나로 여기고 있다. 세계에는 수많은 종류의 술이 존재하며, 각 나라마다 고유의 전통적 방법으로 제조되어 지역을 대표하는 술을 가지고 있다.
우리나라는 유구한 역사에도 불구하고 역사적, 정책적 여러 요인으로 우리의 전통약주를 세계화시키지 못했다. 이에 최근 전통약주에 대한 관심 및 소비증대를 바탕으로 전통약주에 대한 특성을 정확히 파악하고 이를 차별화하고 특성화하는 것이 시급한 실정이다. 이는 전통문화의 계승발전과 더불어 전통약주의 인지도 상승 및 시장 확대를 통해 우리나라 전통약주의 세계화에도 기여하리라 생각된다.
현재 한국 고유의 전통약주는 국화를 우려낸 물에 약초를 달여진 술 그리고 한약재를 첨가한 술과 같이 건강을 앞세운 다양한 전통약주가 시장에서 판매되고 있다. 곡물과 한약재로 사용되는 약용식물의 잎이나 뿌리 등을 사용하고 있어 제조과정 중 이로부터 건강에 이로운 각종 생리기능성 물질이 생성되거나 용출되는 것으로 여겨져 전통약주의 건강기능성 탐색과 활용에 대한 관심이 증대되고 있는 실정이다. 하지만 아직까지 전통약주가 가진 생리기능성에 관한 체계적이고 과학적인 연구가 부족한 실정이다. 그 동안 이루어진 국내 전통약주와 관련된 연구는 대개 발효미생물 및 공정개발에 관련된 연구에 치우쳐져 있었고 전통약주의 생리기능성과 관련하여서는 전반적인 제품의 활성측정에 그쳐 생리기능성관련 핵심사항인 생리활성 물질의 동정 및 분석에 관한 연구는 전무한 실정이다. 생리활성 유효성분의 동정 및 분석을 위해서는 새로운 전통약주 제품의 분획기술(Fractionation)과 이들 각 분획들의 기능성을 신속히 파악하는 기능성 능력 측정법 확립 등의 체계적인 연구기술의 개발이 필수적이다. 세계적으로 와인의 수요가 급증하는 현시점에서 전통주의 우수성을 과학적 연구를 통해 입증한다면 본 실험이 외국 주류와의 품질경쟁에서 우위를 확보하는데 일익을 담당하리라 기대된다. 그리고 전통약주의 기능성 탐색 및 규명을 통한 품질 우수성 입증을 통해 소비자의 전통약주에 대한 인지도를 개선하고 이를 통한 시장 확대에 기여할 수 있을 것이다.
본 실험연구는 3종류의 한국 전통약주(진매, 수국, 구기자)를 중심으로 그 생리기능성(항산화능) 파악을 위한 체계적이고 과학적인 연구방법 및 기술을 확립하고 생리활성 물질을 동정 및 정량 분석함을 목표로 한다.
Ⅱ. 재 료 및 방 법
1. 재 료
(1) 시약 및 표준물질
향기 성분 추출용 용매인 dichloromethane와 수분 건조용 sodium sulfate는 Junsei사 (Japan) 제품을 사용하였다. 향기성분 분획(Fractionation)과정에 사용된 pentane, ethyl acetate, water, methanol 그리고 acetone는 J.T Baker사(USA)을 사용하였다. 항산화 활성 시험에 사용한 hexanal과 undecane은 각각 Sigma사 (St. Louis, MO) 와 Aldrich사 (Millwaukee, WI, USA)제품을 사용하였다.
(2) 실험 재료
본 실험에 사용한 전통약주 진매, 수국, 구기자는 (주)한국발효기술의 시장 판매용 제품을 사용하였다.
2. 방 법
(1) 분획을 이용한 성분 분석
1) 향기 성분 분리
향기 성분 추출을 위한 추출방법은 감압상태에서 SAFE(Solvent assisted flavour extraction)방법을 사용하였다. SAFE장치에 감압을 가하고 전통약주 시료 100ml을 distillation flask에 넣고 water bath상에서 40~45℃로 가열한다. 감압가열에 의해 휘발성분은 distillate flask에서 액체질소에 의해 포집되고 비휘발성분은 distillation flask에 찐덕한 풀 상태로 남게 된다. distillate flask에 냉각 포집된 휘발성분(Extract)은 상온상태에서 녹이고 flask에 50ml의 dichloromethane을 넣어 휘발성분을 dichloromethane층으로 옮기는 Shaking과정을 1시간정도 진행한다. separate funnel을 이용하여 dichloromethane층을 물층(non-volatile)과 분리하고 남은 물층을 distillation flask(비휘발성분)에 가하여 10℃ 냉장고에 보관한다. dichloromethane층에 sodium sulfate를 가하고 12시간동안 5℃의 냉동고에서 보관한다. 수분을 제거하고 vigurus column을 시료가 담긴 flask에 연결하여 50℃로 가열하여 1ml 수준으로 농축 시킨다. 비휘발성분은 rotary evaporator를 사용하여 90℃로 가열하여 1ml수준으로 농축한다.
2) 향기성분의 분획(Fractionation)
glass column(15cm×1cm)에 pentane 용매에 충분히 활성화 된 silica gel(70-230 mesh)을 충진하고 1ml의 농축된 향기추출물을 loading한다. pentane과 ethyl acetate의 비율을 ml단위로 100/0(Fraction ⅰ), 95/5(Fraction ⅱ), 80/20(Fraction ⅲ), 50/50(Fraction ⅳ), 20/80(Fraction ⅴ), 0/100(Fraction ⅵ) 그리고 마지막 200ml의 acetone(Fraction ⅶ)로 총 7가지의 다른 극성도 Fractions을 얻는다. 7가지 fractions을 rotary evaporator로 1ml로 농축시키고 GC/MS로 정성분석하고 GC 6890으로 정량분석하게 된다.
3) GC/MS에 의한 향기성분의 정성분석
Fractionation 과정에서 분리한 휘발성 향기성분의 정성은 gas chromatograph (model 5890, Hewlett-Packard, USA)에mass selective detector (MSD, model 5973, Hewlett-Packard, USA)을 부착한 GC-MSD system을 사용하였다. 향기성분 정성과 정량을 위한 GC의 분석조건으로 컬럼은 DB-WAX bonded-phase fused-silica capillary column (0.32 mm I.D. × 60 m length, 0.25 μm film thickness, J ＆ W Scientific, Folsom. CA)을 사용하였고, injector 온도는 250℃, Oven 온도는 50℃에서 2분간 유지한 다음 분당 3℃로 200℃까지 올린 후 200℃에서 10분간 유지하도록 하였다. 운반기체는 helium을 사용하였고, 평균 유속은 44 cm/s로 고정하였으며 splitless mode로 1μL 주입하였다. 그리고 향기성분 정성을 위한 MS의 분석 조건으로 MS ionization voltage는 70 eV, source temperature는 200℃, interface temperature는 280℃, mass spectrum scan range는 50 ～550 m/z 로 하였다. 향기 성분은 Kovats gas chromatographic retention index I 와 실제 화합물과 비교한 후 각 성분의 Mass Spectrometry (MS) frgmentation, Willy 6th edition MS spectra library 와 실제 성분과 비교하여 정성 분석하였다.
4) 비휘발성분의 분획(Fractionation)
휘발성분을 제외한 비휘발성분을 rotary evaporator로 1ml로 농축시키면 찐덕한 풀 상태로 남게 된다. 이를 XA-2 resin으로 충진한 glass column(40cm×3cm)에 가한다. 1000ml의Fraction 용매비율(water/methanol)을 100/0(Fraction ⅰ), 95/5(Fraction ⅱ), 80/20(Fraction ⅲ), 50/50(Fraction ⅳ), 20/80(Fraction ⅴ), 0/100(Fraction ⅵ) 으로 하고 마지막 1000ml의 acetone(Fraction ⅶ)을 glass column에 연속적으로 가하여 추출물을 얻는다. 7개의 Fractions은 rotary evaporator를 이용하여 최대한 수분을 제거한 상태까지 농축시킨 후 Lipid/MA로 항산화 테스트를 한다.
(2) 산화안전성 측정
1) 휘발성분의 산화안전성 측정(Aldehyde/Carboxylic acid assay)
감압상태의 증기 증류에서 얻어진 추출물의 항산화 활성은 aldehyde/carboxylic acid assay를 사용하여 측정하였다. aldehyde/carboxylic acid assay는 aldehyde가 산화에 의해 carboxylic acid로의 변화의 저해 영향을 알아보는 실험방법이다.
향기 추출물 Fractionⅰ~ⅶ과 GC 내부표준물질로서 undecane(0.2 mg/ml)이 포함된 hexanal(3 mg/mL)을 2ml volumetric flask에 넣고 dichloromethane을 사용하여 mess-up한다. sample은 8ml 밀봉 vial에 담아 60℃로 10분 동안 열처리한 후 30일간 실내온도(15℃)로 저장한다. 각 밀봉 vial은 처음 10일간 (1.5 mL/s, 2 s)로 purging한다. hexanal의 잔존량은 10일 간격으로 확인하고 hexanal의 정량 분석은 flame ionization detector (FID)가 부착된 gas chromatograph (model 5890, Hewlett-Packard, USA)을 사용하였다. Hexanal 정량을 위한 GC의 분석조건으로 컬럼은 HP-1 capillary column (0.32 mm I.D. × 60 m length, 0.25 μm film thickness, Hewlett-Packard, USA)을 사용하였고, injector 온도와 detector온도는 각각 300℃, 280℃이었다. Oven 온도는 40℃에서 2분간 유지한 다음 분당 5℃로 180℃까지 올린 후 180℃에서 10분간 유지하도록 하였다. 운반기체는 helium을 사용하였고, 유속은 1.5 mL/min로 고정하였으며 split ratio는 20:1로 1μL 주입하였다.
2) 비휘발성분의 산화안전성 측정 (Lipid/MA)
각 추출된 비휘발 Fractions을 methanol에 녹여 sample로 만든다. T-tube에 tris-buffer(0.5M) 500ul, (1M) 750㎕, SDS(10g/l) 1ml를 순서대로 넣는다. 그 후 sample을 300μg/ml의 농도를 맞추기 위한 각 Fraction의 ㎕를 넣는다. (0.01M) 100㎕, (0.3%) 23㎕를 넣어준다. 산화시킬 지방산인 cod liver oil를 30㎕ 넣어준 후 증류수를 가해준다. 37℃에서 16~17시간 정도 overnight 시키고 이때 화학적 반응이 일어나도록 shaking 시켜준다. N-methylhydrazine을 30㎕ 가한 후 1시간동안 shaking 한다. 이때의 온도는 상온으로 하며 160rpm의 속도로 한다. 지방산의 산화로 생성된 Malonaldehyde가 1-Methyl pyrazole로 변환된다. SPE를 사용해 용매를 바꿔주는데, SPE는 C18 카트리지로 ethylacetate, methanol, water 순서로 5ml씩 두번 넣어서 conditioning 시켜준다. Fraction을 통해 얻은 Fraction sample을 다 넣어 준다. water를 5ml넣어 준 후 ethyl acetate를 5ml씩 2번 넣어 준다. 이때 ethyl acetate를 넣은 후 빠져나오는 추출액을 받고 Internal standard를 찍기 위해서 2-methyl pyrazine을 20㎕ 넣어준다. ethyl acetate 10ml로 mess up 한고 GC6890(NPD, Split 20:1, oven temp 60℃~180℃)로 항산화능을 확인한다.
Ⅲ. 결 과 및 고 찰
1. GC에 의한 용매 검량선
hexanal의 농도를 0.5㎍/ml～ 5㎍/ml로 만들었고 injector 온도는 250℃, Oven 온도는 50℃에서 2분간 유지한 다음 분당 3℃로 200℃까지 올린 후 200℃에서 10분간 유지하도록 하였다. 운반기체는 helium을 사용하였고, 평균 유속은 44 cm/s로 고정하였으며 splitless mode로 1 μL주입하였다. GC/MS에 주입한 결과 검량선은 그림. 1과 같다. 검량선에서 hexanal의 농도(0.5㎍/ml～ 5㎍/ml)에 대한 hexanal/undecane을 회기분석한 결과는 Table 1과 같다. solvent는 0.9999의 정의 상관 관계 (r)가 성립하였다.
그림 1. Calibration lines for GC/MS of solvent.
2. 전통약주의 향기 성분 확인
1) 진매의 향기 성분과 함량
진매에서 추출한 향기성분은 Mass Spectrometry (MS) fragmentation, Willy 6th edition MS spectra library 와 실제 성분과 비교하여 유사성이 60% 이상인 향기 성분을 표 1에 나타내었다. 34개의 향기성분이 확인되었고 주요 향기성분은 Fractionⅰ에서 toluene(68.28%), 4,7-dimethyl-undecane(3.67%), Fraction ⅱ는 3-methyl butanol(50.22%), 3-(difluromethyl)pyridine(3.55%), Fraction ⅲ는 benzeneethanol(32.27%), ethyl 4-hydroxybutanoate(16.44%), Fraction ⅳ는 hexadecanoic acid(72.17%), Fraction ⅴ는 acetic acid(19.77%), 2-butoxy-ethanol(11.53%), 1,2-benzenedicarboxylic acid(7.37%) 그리고 Fraction ⅶ는 2-pentanone(89.87%)로 확인 되었다.
표 1. 진매의 향기성분
Major Volatile Compounds in Jinmaecompoundskovats Index1)ppm2)Fraction ⅰtoluene10502.61p-xylene11520.061,4-dimethyl-undecane13200.01docosane15210.091,2-dithiacyclopentane15390.012,6-bisphenol23290.04Fraction ⅱiso butyl alcohol10482.863-methyl butanol121934.3ethyl 2-hydroxycaproate15610.153-(difluromethyl)pyridine17190.19hexanoic acid21570.274-ethyl-2-methoxy-phenol23480.12octanoic acid23720.14Fraction ⅲ2(3H)-furanone16711.48pentanoic acid17150.26methinol18640.46benzeneethanol21317.32ethyl 4-hydroxybutanoate21502.72Fraction ⅳbutan-4-olide16729.54hexadecanoic acid248347.22Fraction ⅴacetic acid10482.53m-xylene11490.282-ethoxy-ethanol13121.322-butoxy-ethanol14182.51butanoic acid16520.462-butenoic acid20221.051,2-benzenedicarboxylic acid248220.06Fraction ⅵethyl benzene11350.2octadecanoic acid248127.49Fraction ⅶ3-hexen-2-one11440.062-pentanone1386127.153-hexanol15430.24propanoic acid15520.111-butanamine15603.87
1)I mean Kovats retention index on DB-WAX.
2)Solvent peak excluded.
2) 수국의 향기 성분과 함량
수국에서 추출한 향기성분은 Mass Spectrometry (MS) frgmentation, Willy 6th edition MS spectra library 와 실제 성분과 비교하여 유사성이 60% 이상인 향기 성분을 표 2에 나타내었다. 30개의 향기성분이 확인되었고 주요 향기성분은 Fractionⅰ에서 toluene(73.35%), Fraction ⅱ는 Iso butyl alcohol(56.70%), benzeneethanol(22.41%), Fraction ⅲ는 ethyl 4-hydroxybutanoate(55.60%), methionol(2.44%), Fraction ⅳ는 hexadecanoic acid(72.17%), Fraction ⅴ는 propanoic acid(33.57%), thiocyanoic acid(12.48%), 3-pyrrolidinol(6.55%), Fraction ⅵ는 2-butoxy-ethanol(40.20%), 2-ethoxy-ethanol(16.74%) 그리고 Fraction ⅶ는 4-hydroxy-4-methyl-2-pentanone(90.15%), 2-pentene(5.55%)가 확인 되었다.
Major Volatile Compounds in Sukukcompoundskovats Index1)ppm2)Fraction ⅰtoluene10483.84undecane12500.23Fraction ⅱiso amyl alcohol122132.743-furaldehyde14800.312-methyl-4-octanol15610.16pentanoic acid17200.35hexanoic acid21580.31benzeneethanol223315.54Fraction ⅲmethinol213722.03ethyl 4-hydroxybutanoate223418.35Fraction ⅳ1,4-dimethyl-benzene11501.32trans-4-hydroxymethyl-2-methyl-1,3-ethane16641.392H-pyran16690.05Fraction ⅴethyl benzene11520.19thiocyanoic acid13130.82propanoic acid14211.541,2-dimethyl-hydrazine14640.253-pyrrolidinol237710.31Fraction ⅵbutyl acetate10500.77o-xylene11520.142-ethoxy-ethanol13130.662-butoxy-ethanol14211.29Fraction ⅶ2-pentene11440.06 4-hydroxy-4-methyl-2-pentanone1386127.15 표 2. 수국의 향기성분
1)I mean Kovats retention index on DB-WAX.
2)Solvent peak excluded.
3) 구기자의 향기 성분과 함량
구기자에서 추출한 향기성분은 Mass Spectrometry (MS) frgmentation, Willy 6th edition MS spectra library 와 실제 성분과 비교하여 유사성이 60% 이상인 향기 성분을 표 3에 나타내었다. 28개의 향기성분이 확인되었고 주요 향기성분은 Fractionⅰ에서 toluene(83.50%), 1,3-dimethyl-benzene(5.52%), Fraction ⅱ는 1-pentanol(70.44%), butanedioic acid(6.24%) Fraction ⅲ는 benzeneethanol(46.66%), dihydro-2(3H)-furanone(2.17%), Fraction ⅳ는 α-ketoglutaric acid(22.10%), butanoic acid(3.21%), Fraction ⅴ는 acetic acid(7.25%), Fraction ⅵ는 2-butoxy-ethanol(47.06%), 2-ethoxy-ethanol(16.91%), butyl acetate(7.27%) 그리고 Fraction ⅶ는 2-pentanol(84.93%), 2-pentanone(3.89%)이였다.
표 3. 구기자의 향기성분
Major Volatile Compounds in Kukijacompoundskovats Index1)ppm2)Fraction ⅰtoluene10501.491,4-dimethyl-benzene11520.121,3-dimethyl-benzene11950.07Fraction ⅱ2-methyl-1-propanol10501.071-pentanol121917.372-furancarboxaldehyde14830.062,6-dimethyl-4-heptanol15640.16butanedioic acid18040.644-propylbutan-4-olide23746.962,5-xylenol243712.7Fraction ⅲiso butyl alcohol10351.611,2-dimethyl-benzene10850.113-methyl-1-butanol11560.172(3H)-furanone16864.962-furanmethanol17321.85bezeneethanol223830.951-(1H-pyrrol-2-yl)-ethanone22820.09Fraction ⅳbutanoic acid16864.46ethyl 4-hydroxybutanoate21340.78αα-ketoglutaric acid23734.49Fraction ⅴacetic acid10570.56Fraction ⅵbutyl acetate10500.992-ethoxy-ethanol13130.752-butoxy-ethanol14211.44Fraction ⅶ3-methyl-2-pentanone11511.642,4-dimethyl-2-pentanol138852.88propanoic acid15660.94
1)I mean Kovats retention index on DB-WAX.
2)Solvent peak excluded.
3. Aldehyde/Carboxylic acid assay를 이용한 휘발성분의 항산화능 측정
3종류의 전통약주에서 추출한 향기성분 각 fractions의 농도를 100μg/ml로 하고 10일간 15℃ 항온기에서 보관한 후 hexanal의 잔존량을 10일 간격으로 측정한 결과는 그림 1~3과 같다. 각 fraction sample은 3배수 (n=3)로 실험하였다.
1)진매의 항산화능 측정
그림2는 진매로부터 추출된 향기성분 fractions에 대해 측정된 항산화 효과를 보여준다. 30일 후에 진매로부터 추출된 향기성분을 첨가하지 않은 control(0 μg/ml)은 hexanal에서 hexanoic acid로의 산화가 89.55% 일어났다. 진매의 Fraction ⅳ(butan-4-olide, hexadecanoic acid)에서는 hexanal의 산화가 62.44%로 나타났다. 그리고 Fractionⅰ와 Fraction ⅱ에서 80.64%, 60.15% 산화가 이루어졌다. hexanal이 남아있는 percentage는 Fractionⅰ~ⅶ까지 각각 19.36%, 9.01%, 37.56%, 14.35%, 1.38%, 1.36%이었다.
그림 2. Hexanal에 대한 각 fraction에서의 진매 향기 추출물의 항산화 효과
day0102030control10028.91±5.2715.86±±6.7610.45±±11.53Fraction i10065.02±±13.6426.45±±21.9419.36±±16.90Fraction ii100---Fraction iii10042.54±±18.9816.44±±11.249.01±±6.85Fraction iv10054.8±±29.3730.04±±24.5837.56±±3.45Fraction v10036.36±±38.0120.76±±27.1614.35±±19.92Fraction vi10021.66±±14.806.62±±6.831.38±±0.88Fraction vii10035.42±±26.974.6±±2.561.36±±0.79표 4. Hexanal에 대한 각 fraction에서의 진매 향기 추출물의 항산화 효과
2)수국의 항산화능 측정
그림2는 수국으로부터 추출된 향기성분 fractions에 대해 측정된 항산화 효과를 보여준다. 30일 후에 수국으로부터 추출된 향기성분을 첨가하지 않은 control(0 μg/ml)은 hexanal에서 hexanoic acid로의 산화가 50.69% 일어났다. 수국의 Fraction ⅶ(4-hydroxy-4-methyl-2-pentanone, 2-pentene)에서는 hexanal의 산화가 2.62%로 나타났다. 그리고 Fraction ⅳ와 Fraction ⅴ에서 8.27%, 13.06% 산화가 이루어졌다. hexanal이 남아있는 percentage는 Fractionⅰ~ⅶ까지 각각 77.91%, 5.42%, 40.53%, 91.73%, 86.94%, 0.5%, 97.38%이었다.
그림 3. Hexanal에 대한 각 fraction에서의 수국 향기 추출물의 항산화 효과
day0102030control10097.72±9.8575±22.8649.31±38.08Fraction ⅰ100102±3.0895.21±8.2177.91±26.85Fraction ⅱ10091.14±5.6929.21±10.565.42±3.83Fraction ⅲ10065.42±49.1949.97±50.7140.53±52.35Fraction ⅳ100100.71±0.6495.29±1.5691.73±6.31Fraction ⅴ10098.94±2.5095.13±4.1186.94±10.59Fraction ⅵ10056.02±8.058.98±3.910.5±0.18Fraction ⅶ100103.2±3.2299.65±3.6997.38±2.70표 5. Hexanal에 대한 각 fraction에서의 수국 향기 추출물의 항산화 효과
3)구기자의 항산화능 측정
그림3은 구기자로부터 추출된 향기성분 fractions에 대해 측정된 항산화 효과를 보여준다. 30일 후에 구기자로부터 추출된 향기성분을 첨가하지 않은 control(0 μg/ml)은 hexanal에서 hexanoic acid로의 산화가 98.18% 일어났다. 구기자의 Fraction ⅳ(α-ketoglutaric acid, butanoic acid)에서는 hexanal의 산화가 29.25%로 일어났다. 그리고 Fraction ⅲ에서 49.53% 산화가 이루어졌다.
그림 4. Hexanal에 대한 각 fraction에서의 구기자 향기 추출물의 항산화 효과
표 6. Hexanal에 대한 각 fraction에서의 구기자 향기 추출물의 항산화 효과
day0102030control10024.14±25.478.93±11.741.82±2.18Fraction i100---Fraction ii10074.75±42.3851.85±43.1916.41±14.12Fraction iii10085.09±27.0057.86±61.9450.47±69.67Fraction iv100103.37±4.0187.34±13.3271.75±25.62Fraction v10063.86±27.2617.5±15.807.3±9.13Fraction vi100---Fraction vii10045.55+48.303.47±0.410.75±0.77
4. Lipid/MA를 이용한 비휘발성분의 항산화능 측정
전통약주의 비휘발 성분 농도를 300μg/ml으로 하여, MA와 NMH반응으로 생성된 1-MP를 정량한 결과는 그림 4~6과 같다. 각 fraction sample은 3배수 (n=3)로 실험하였고, 항산화 능력은 1-MP의 peak area를 2-MP (internal standard)의 peak area로 나눈 값을 구하여 lipid 산화에 대한 비휘발 추출물의 다른 극성에 따른 fractions의 저해 영향을 percentage로 나타내었다.
1)진매의 항산화능 측정
그림 4는 진매로부터 추출된 비휘발성분의 각 Fractions에 대해 측정된 항산화 효과를 보여준다. control과 비교하여 Fractionⅴ가 가장 높은 46.06%까지 MA형성을 저해한 것으로 나타났다. 이는 Fractionⅶ과 Fractionⅳ의 추출물에서 각각 42.12%, 38.06%의 항산화효과가 있음을 나타났다.
그림 5. 각 Fractions에서 cod liver oil로부터 형성된 MA에 대한 진매 비휘발 추출물의 항산화 효과
Inhibitory Effect(%)Fractionⅰ17.17±26.58Fractionⅱ27.37±2.21Fractionⅲ24.02±7.33Fractionⅳ38.06±9.00Fractionⅴ46.06±10.94Fractionⅵ37.03±10.24Fractionⅶ42.12±17.40
2)수국의 항산화능 측정
그림 5는 수국으로부터 추출된 비휘발성분의 각 Fractions에 대해 측정된 항산화 효과를 보여준다. control과 비교하여 Fraction ⅳ가 가장 높은 68.87%까지 MA형성을 저해한 것으로 다른 2종류의 술과 비교하여 가장 높은 항산화능을 보였다. Fractionⅰ과 Fractionⅴ에서는 각각 59.56%, 52.48%로 이외 수국의 fractions도 다른 2종류의 술과 비교하면 전체적으로 높은 항산화효과 비휘발성분을 함유하고 있음을 보여주었다.
그림 6. 각 Fractions에서 cod liver oil로부터 형성된 MA에 대한 수국 비휘발 추출물의 항산화 효과
Inhibitory Effect(%)Fractionⅰ59.56±7.15Fractionⅱ44.54±5.14Fractionⅲ36.19±8.02Fractionⅳ68.87±3.38Fractionⅴ52.48±14.78Fractionⅵ30.91±10.11Fractionⅶ52.04±11.30
4) 구기자의 항산화능 측정
그림 6은 구기자로부터 추출된 비휘발성분의 각 Fractions에 대해 측정된 항산화 효과를 보여준다. control과 비교하여 Fractionⅰ에서 가장 높은 64.53%까지 MA형성을 저해한 것으로 항산화능을 보였다. 그리고 Fractionⅶ과 Fractionⅴ에서는 각각 55.46%, 45.65%로 항산화효과가 나타났다.
그림 7. 각 Fractions에서 cod liver oil로부터 형성된 MA에 대한 구기자 비휘발 추출물의 항산화 효과
Inhibitory Effect(%)Fractionⅰ64.53±1.82Fractionⅱ25.64±15.45Fractionⅲ42.35±2.30Fractionⅳ43.71±4.94Fractionⅴ45.65±13.66Fractionⅵ37.84±18.24Fractionⅶ55.46±7.83
Ⅳ. 결 론
전통약주 실험을 통해 한국 전통약주가 가지고 있는 항산화능을 Fractions간 비교 관찰하기 위해 본 연구의 우선과제였던 분획기술을 확립하였고 휘발성분과 비휘발성분을 추출하여 휘발성분의 정성 및 정량 분석 그리고 각 분획들이 지닌 항산화능을 관찰해보았다. 전통약주의 휘발성분(향기성분)은 감압상태의 dichloromethane을 용매로한 SAFE 추출장치를 이용하여 추출하였고 이를 GC/MS를 사용하여 정성 및 정량할 수 있었다. 하지만 비휘발성분에 대한 정성 및 정량 기술부족과 방법을 확립하지 못한 상태에서 항산화능을 검증하여 분획의 의미에 부족함을 느낀다. 앞으로 HPLC를 이용한 전통약주 비휘발성분의 정성 정량분석방법에 대한 연구가 필요하겠다.
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3. K. Yanagimoto, H. Ochi, K. G. Lee, and T. Shibamoto., Antioxidative activities of volatile extracts from green tea, oolong tea, and black tea. J. Agric Food Chem. 51(2003), pp. 7396-7401
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Abstract
Antioxidative activity of volitile/non-volitile fractions in Korean traditional liquors
By
Kyu-Dong Kim, Jae-Young Her,
Soo-Hoon Ahn, Hee-Jin Kim
Adviser : Prof. Kwang-Geun Lee
Department of Food Science & Technology
Dongguk University
Seoul, Korea
Volatile extracts from three Korean traditional liquors(jinmae, sukuk, kukija) were extracted with dichloromethane using a SAFE(solvent assisted flavor extraction) apparatus and divided volatile extracts into seven fractions. The volatile fractions obtained from fractionation at 1㎍/㎖ were identified using a Gas chromatography-mass spectrometry and Gas chromatography-flame ionization detector. The major volatile compounds at each fractions of jinmae were 3-methyl butanol(34.30㎍/㎖), benzeneethanol(7.32㎍/㎖), hexadecanoic acid(47.22㎍/㎖), 1,2-benzenedicarboxylic acid(20.26㎍/㎖), and 2-pentanone(127.15㎍/㎖). The fractions of sukuk presents Iso amy alcohol(32.74㎍/㎖), methinol(22.03㎍/㎖), ethyl 4-hydroxybutanoate(18.35㎍/㎖) and 3-pyrrolidinol(10.31㎍/㎖). And the fraction of kukija presents 1-pentanol(17.37㎍/㎖), 2,5-xylenol(12.70㎍/㎖), 2(3H)-furanone(4.96㎍/㎖), benzeneethanol(30.95㎍/㎖) and α-glutaric acid(4.49㎍/㎖).
감사의 글
졸업을 앞에 두고 지나간 시간을 돌아보면 선배, 동기, 후배들과 열심히 공부하며 즐겁게 생활하던 E317이 생각납니다. 시험 때 나의 궁금증을 풀어주던 네이버벽, 그리고 이젠 정들어버린 4학년 졸업반 학우들에게 고마운 마음을 전하고 싶습니다.
우선 학부생으로 이 논문실험에 참여할 수 있었고 옆에서 지도해주신 이광근 교수님께 진심으로 감사와 존경의 마음을 전하고 싶습니다. 그리고 학문적 가르침을 주신 우리 식품공학과 노완섭 교수님, 이승주 교수님, 홍광원 교수님, 유병승 교수님께 감사의 마음을 전합니다.
이 논문 실험을 완성하기까지 정말 큰 도움을 준 혜원이 그리고 재영, 수훈, 희진, 재욱에게 항상 감사한 마음을 가지고 있습니다.
그리고 제가 힘들 때 옆에서 도움과 격려를 아끼지 않았던 우리 식품공학과 동기후배들 태수, 호경, 경상, 정일, 다혜, 혜영이, 보람이, 재은, 영주, 병기, 원호, 인진, 장원 모두에게 감사합니다.
정말 중요한 사람이 있었군요. 연구실험 과제는 달랐지만 의견을 나누고 고충을 나눈 강인애에게 정말 고마움을 전하고 싶습니다.
동국대 식품공학과 여러분 파이팅!~
김규동 외
식품공4